細(xì)胞培養(yǎng)需注意事項(xiàng)

細(xì)胞培養(yǎng)在生命科研的地位舉足輕重。實(shí)驗(yàn)君的很多成果可謂是成也細(xì)胞培養(yǎng)，敗也細(xì)胞培養(yǎng)。然而細(xì)胞虐我千百遍，我待細(xì)胞如初戀！科研人是不會(huì)這么被輕易打敗的。

公司主營(yíng)業(yè)務(wù)：胎牛血清（HAKATA、HyClone、SERANA、NTC、Corning、BOVOGEN、PAA、PAN、SIGMA），無(wú)外泌體血清(SBI)，ELISA試劑盒，細(xì)胞（400多種類通過(guò)STR鑒定），培養(yǎng)基（干粉、液體），雙抗，胰酶，CST,abcam,sigma等抗體。詳詢。

新買或惠贈(zèng)的細(xì)胞

1.新買的或惠贈(zèng)的細(xì)胞如何處理？

不管買的細(xì)胞、惠贈(zèng)的細(xì)胞，剛拿到手應(yīng)趕緊做這幾件事：檢測(cè)瓶子是否破裂；培養(yǎng)基是否漏出，是否渾濁；是否有支原體污染；迅速擴(kuò)增凍存。

2.能否使用與原先培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基？

不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，若驟然使用和原先提供培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基，細(xì)胞大都無(wú)法立即適應(yīng)，造成細(xì)胞無(wú)法存活。

3.購(gòu)買的細(xì)胞死亡或存活率不佳可能原因？

常見(jiàn)原因可能有：培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳；血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳；解凍過(guò)程錯(cuò)誤；冷凍細(xì)胞解凍后，加以洗滌細(xì)胞和離心；懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞；培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤；培養(yǎng)箱氣體濃度達(dá)不到要求；細(xì)胞置于 –80 ℃ 太久。

復(fù)蘇凍存的細(xì)胞

4.收到的冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落的原因？

冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因?yàn)椴僮髡邐A取冷凍管時(shí)用力不當(dāng)，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動(dòng)或松脫，是因熱脹冷縮的物理現(xiàn)象，冷凍管有可能因此而造成細(xì)胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時(shí)，均應(yīng)立刻將冷凍管再一次扭緊。

5.冷凍管應(yīng)如何解凍？

將冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí)，必須注意安全，可佩戴防護(hù)眼鏡和手套預(yù)防冷凍管的爆裂。取出冷凍管后，須立即放入 37 ℃ 水浴環(huán)境中快速解凍，輕搖冷凍管使其在 1 分鐘內(nèi)全部融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損害。并注意水面不可超過(guò)冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。

6.細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí)，是否應(yīng)馬上去除 DMSO？

現(xiàn)在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室會(huì)在解凍細(xì)胞后加培養(yǎng)液將DMSO除去，但也有研究者認(rèn)為除少數(shù)特別注明對(duì) DMSO 敏感的細(xì)胞外，絕大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞），在解凍之后，可直接放入含有 10~15 ml 新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)角瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除 DMSO 即可，如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)或貼附的問(wèn)題。

細(xì)胞培養(yǎng)用液

7.如何正確選擇培養(yǎng)基種類？

引用幾款比較經(jīng)典的培養(yǎng)基舉例：

8.如何選用特殊細(xì)胞系培養(yǎng)基？

培養(yǎng)某一類型細(xì)胞沒(méi)有固定的培養(yǎng)條件。在 MEM 中培養(yǎng)的細(xì)胞，很可能在 DMEM 或 M199 中同樣很容易生長(zhǎng)。總之，shou選 MEM 做粘附細(xì)胞培養(yǎng)，RPMI-1640 做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是一個(gè)好的開(kāi)始。

9.什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？

酚紅在培養(yǎng)基中被用來(lái)作為 PH 值的指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素）。為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí)，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測(cè)，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測(cè)時(shí)，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。

10.細(xì)胞培養(yǎng)基的配制和儲(chǔ)存應(yīng)該注意什么？

細(xì)胞培養(yǎng)基配好后，要先抽取少許放入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)放置24~48h，已檢測(cè)培養(yǎng)液是否有污染，然后方可用于實(shí)驗(yàn)。配置培養(yǎng)基所需的血清要合格并且保持穩(wěn)定。一個(gè)批號(hào)試用效果良好后，就可一次購(gòu)入較多同一批號(hào)的血清，這樣實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定，配液時(shí)調(diào)整pH值較容易。每次配液量以使用兩周左右的量為宜，一次配液不要太多，一是短期內(nèi)用不完造成營(yíng)養(yǎng)成分損失需要補(bǔ)充，二是量大易造成污染。

11.為何培養(yǎng)基保存于 4 ℃ 冰箱中，顏色會(huì)偏紫色？

培養(yǎng)基保存于 4 ℃ 冰箱中，培養(yǎng)基內(nèi)的 CO2 會(huì)逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來(lái)越偏堿性，而培養(yǎng)基中的酸堿指示劑 （通常為 phenol red） 的顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏紫色。培養(yǎng)基偏堿的結(jié)果， 將造成細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時(shí)，可以通入無(wú)菌過(guò)濾 CO2，以調(diào)整 pH 值。

12.什么情況下用到無(wú)血清培養(yǎng)基？

對(duì)于應(yīng)用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行分離制備細(xì)胞生長(zhǎng)因子、單克隆抗體等應(yīng)該選擇無(wú)血清培養(yǎng)基。

13.如何選擇正確的血清種類？

14.可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的血清種類？

不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，所以血清的種類和品質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生極大的影響。來(lái)自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯(cuò)誤常會(huì)造成細(xì)胞無(wú)法存活。

15.血清滅活是否必須？

這個(gè)問(wèn)題現(xiàn)在有爭(zhēng)議。有人主張價(jià)格不菲的血清中含有諸如生長(zhǎng)因子，維生素，氨基酸等珍貴物質(zhì)，而將它們置于50℃以上的溫度長(zhǎng)達(dá)30分鐘的熱處理會(huì)對(duì)血清中的生長(zhǎng)因子，氨基酸等成分帶來(lái)的負(fù)面影響。盡管如此，在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室之中血清的熱滅活還是作為常規(guī)來(lái)執(zhí)行，尤其是在昆蟲細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)中。

16.培養(yǎng)基中是否添加抗生素？

除特殊篩選系統(tǒng)中外，一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。

17.何時(shí)更換培養(yǎng)基？

視細(xì)胞生長(zhǎng)密度而定，或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上的更換時(shí)間，按時(shí)更換培養(yǎng)基即可。

細(xì)胞傳代

18.細(xì)胞傳代的方法都有哪些？

根據(jù)不同的細(xì)胞采取不同的方法。貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞用消化法傳代；部分貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞用直接吹打即可傳代；懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞可以采用直接吹打或離心分離后傳代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打。

19.原代培養(yǎng)的傳代應(yīng)注意的問(wèn)題？

細(xì)胞沒(méi)有生長(zhǎng)到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面以前，不要急于傳代；原代培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞多為混雜生長(zhǎng)，不同的細(xì)胞有不同的消化時(shí)間，因此要根據(jù)需要注意觀察及時(shí)處理，并根據(jù)不同細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的耐受時(shí)間而分離和純化所需要的細(xì)胞；

吹打細(xì)胞時(shí)動(dòng)作要輕巧盡可能減少對(duì)細(xì)胞的損傷；傳代時(shí)細(xì)胞接種數(shù)量要多一些，使細(xì)胞能盡快適應(yīng)新環(huán)境而利于細(xì)胞生存和增值；隨消化分離而脫落的組織塊也可一并傳入新的培養(yǎng)瓶。

20.使用胰蛋白酶時(shí)加入EDTA的目的？應(yīng)如何處理？

EDTA作用較胰蛋白酶緩和，主要作用在于能從組織生存環(huán)境中吸取Ca2+、Mg2+，這些離子是維持組織完整的重要因素。但EDTA單獨(dú)使用不能使細(xì)胞*分散，因而常與胰蛋白酶按不同比例混合使用，效果較好。常用比例為1：1或者2份EDTA：1份胰蛋白酶。EDTA的工作液濃度為0.02%，用不含Ca2+、Mg2+的BSS配置。如果使用EDTA，在終止消化前，需用緩沖液將消化液清除后才能加培養(yǎng)液。次開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中，保存于 –20 ℃，避免反復(fù)冷凍解凍造成胰蛋白酶的活性降低，并可減少污染的機(jī)會(huì)。

21.欲將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來(lái)，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？

欲回收動(dòng)物細(xì)胞，其離心速率一般為800~1000 rpm，5~10 分鐘，過(guò)高的轉(zhuǎn)速，將造成細(xì)胞死亡。

22.細(xì)胞的接種密度為何？

依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上的接種密度或稀釋分盤的比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)的重要原因之一。

23.細(xì)胞交叉污染的可能原因？

多種細(xì)胞系進(jìn)行維持傳代操作時(shí)，各細(xì)胞系所需的器材和溶液沒(méi)有嚴(yán)格分開(kāi)，往往會(huì)使一種細(xì)胞被另一種細(xì)胞污染。

細(xì)胞凍存

24.冷凍培養(yǎng)基為什么要加DMSO？

因?yàn)榧?xì)胞在不加任何保護(hù)劑的情況下直接凍存時(shí)，細(xì)胞內(nèi)外的水分都會(huì)很快形成冰晶，冰晶的形成將造成細(xì)胞損傷，還可引起細(xì)胞的的死亡。目前多采用甘油和DMSO做保護(hù)劑。這兩種細(xì)胞無(wú)明顯毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞，可以使冰點(diǎn)下降，提高包膜對(duì)水的通透性。

25.DMSO 的等級(jí)和無(wú)菌過(guò)濾的方式為何？

冷凍保存使用的 DMSO 等級(jí)，必須為 Tissue culture grade 的 DMSO，其本身即為無(wú)菌狀況，次開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中，保存于 4 ℃，避免反復(fù)冷凍解凍造成 DMSO 的裂解而釋出有害物質(zhì)，并可減少污染的機(jī)會(huì)。若要過(guò)濾 DMSO，則須使用耐 DMSO 的 Nylon 材質(zhì)濾膜。

26.欲冷凍保存時(shí)，細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？

冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為 1x106 cells/ml vial，融合瘤細(xì)胞則以 5x106 cells/ml vial 為宜。

27.冷凍保存細(xì)胞的方法？

冷凍保存方法一：冷凍管置于 4 ℃ 30~60 分鐘 →-20 ℃ 30 分鐘 → -80 ℃ 16~18 小時(shí)（或隔夜） → 液氮槽 vapor phase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

冷凍保存方法二： 冷凍管置于已設(shè)定程序的可程序降溫機(jī)中每分鐘降 1~3 ℃ 至 –80 ℃ 以下， 再放入液氮槽 vapor phase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存。–20 ℃ 不可超過(guò) 1 小時(shí)，以防止冰晶過(guò)大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過(guò)此步驟直接放入 –80 ℃ 冰箱中，存活率稍微降低一些。

28.細(xì)胞凍存太多會(huì)不會(huì)浪費(fèi)？

每一種細(xì)胞系都應(yīng)有充足的凍存儲(chǔ)備，防止由于細(xì)胞污染等因素造成的細(xì)胞系的絕種，而且每一批次培養(yǎng)的細(xì)胞狀態(tài)都不同，應(yīng)該挑選幾個(gè)狀態(tài)較好的批次凍存保種。另外二倍體細(xì)胞等有限細(xì)胞系如果暫時(shí)不用凍存以免傳代太多，造成細(xì)胞衰老或者發(fā)生改變。

29.如何識(shí)別和預(yù)防常見(jiàn)的細(xì)胞污染？

細(xì)菌污染：細(xì)菌是一種原核細(xì)胞微生物，其大小以微米(μm)計(jì)。常見(jiàn)的污染細(xì)菌有革蘭氏陰性菌和大腸桿菌、假單胞菌等，革蘭氏陰性菌中白色葡萄球菌等比較常見(jiàn)。

一旦發(fā)生細(xì)菌污染較易發(fā)現(xiàn)，多數(shù)情況下培養(yǎng)液短期內(nèi)顏色變黃，表明有大量酸性物質(zhì)產(chǎn)生，出現(xiàn)明顯混濁現(xiàn)象；有時(shí)靜置的培養(yǎng)液液體初看不混濁，但稍加振蕩，就有很多混濁物漂起。倒置顯微鏡下觀察，可見(jiàn)培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮。必要時(shí)可取少量培養(yǎng)液涂片染色檢查以證實(shí)細(xì)菌種類；有的培養(yǎng)液改變不明顯而又疑有污染，可取出少量培養(yǎng)液用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養(yǎng)液接種，也可取10ml細(xì)胞懸液以100rpm離心5min，沉淀中加入無(wú)抗生素的培養(yǎng)液2ml，置于37℃培養(yǎng)，24h可得結(jié)果。污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，后變圓脫落死亡，造成試驗(yàn)失敗和細(xì)胞株(系)丟失。

看到這種，別猶豫了你的細(xì)胞被污染了，那么怎么辦呢，基本原則立馬扔掉，別擴(kuò)大污染，如果你的細(xì)胞真的十分寶貴，先用帶有雙抗的PBS反復(fù)沖洗幾遍，然后再培養(yǎng)液中加入硫酸慶大霉素、新霉素（50ug/ml）等，培養(yǎng)3天后換成帶有雙抗的培養(yǎng)液培養(yǎng)。

真菌污染：是細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中常見(jiàn)的一種，尤其在梅雨季節(jié)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)更易污染。污染培養(yǎng)細(xì)胞的多為煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。霉菌污染后多數(shù)在培養(yǎng)液中形成白色或淺黃色漂浮物。一般肉眼可見(jiàn)，較易被發(fā)現(xiàn)，短期內(nèi)培養(yǎng)液多不混濁，倒置顯微鏡下可見(jiàn)于細(xì)胞之間縱橫交錯(cuò)穿行的絲狀、管狀、及樹(shù)枝狀菌絲，并懸浮飄蕩在培養(yǎng)液中。很多菌絲在高倍鏡可見(jiàn)到有鏈狀排列的菌珠；念珠菌或酵母菌形態(tài)呈卵形，散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間生長(zhǎng)。鏡下看時(shí)，要將培養(yǎng)瓶用酒精棉球擦干凈，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長(zhǎng)的菌絲相混淆。真菌污染后，細(xì)胞生長(zhǎng)變慢，但后由于營(yíng)養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡。

真菌污染真的不建議處理，因?yàn)殒咦尤菀罪h散，可能這瓶沒(méi)9過(guò)來(lái)，又?jǐn)U大了污染，建議預(yù)防為主，在培養(yǎng)箱的水中加入硫酸銅，就是藍(lán)色的那種東西。哎，如果你非救不可，可以采用兩性霉素B（0.25-2.5），三天后換液加入含PS的培養(yǎng)液。

支原體污染：支原體是一種大小介于細(xì)菌和病毒之間(小直徑0．2um)并獨(dú)立生活的微生物。約有1%可通過(guò)濾菌器。支原體無(wú)細(xì)胞壁形態(tài)呈高度多形性。可為圓形、絲狀或梨形。

支原體形態(tài)多變，在光境下不易看清內(nèi)部結(jié)構(gòu)。電鏡下觀察支原體膜為三層結(jié)構(gòu)。其中央有電干密度大的密集顆粒群或絲狀的中心束。支原體多吸附或散在于細(xì)胞表面和細(xì)胞之間。橫斷面與細(xì)胞微絨毛相似，但微絨毛電子密度比支原體小，且中央無(wú)顆粒群或中央束。

支原體污染細(xì)胞后，培養(yǎng)液可不發(fā)生混濁。多數(shù)情況下細(xì)胞病理變化輕微或不顯著，細(xì)微變化也可由于傳代、換液而緩解，因此易被忽視。但個(gè)別嚴(yán)重者，可致細(xì)胞增殖緩慢，甚至從培養(yǎng)器皿脫落。

如果懷疑細(xì)胞被支原體污染可使用支原體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，如果確定是支原體污染可以選擇支原體去除試劑進(jìn)行處理。