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H1975/培美曲塞-H1975/培美曲塞耐藥株培養(yǎng)
2017-04-12 瀏覽次數(shù)：1469
1.試劑和溶液
1）轉(zhuǎn)印緩沖液：0.025M Tris base , 0.187 M甘氨酸 , 25%甲醇
2）氨基黑溶液：
3）1×TBST：25mM Tris-HCl ( pH 8.0 ) , 0.2 M NaCl ,0.1%Tween 20
4）封閉液：TBST配制的5%牛奶
5）抗體稀釋液：TBST配制的5%牛奶
6）顯色系統(tǒng)：ECL顯色
2.實(shí)驗(yàn)步驟
1電泳：將裂解液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，80v，30分鐘，120v，90分鐘；
2轉(zhuǎn)膜：PVDF膜在甲醇中浸泡約30秒左右，濾紙浸泡在轉(zhuǎn)印緩沖液預(yù)濕，半干法轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，10v，150分鐘；
3染色：氨基黑染色5分鐘，甲醇褪去背景色，觀察條帶；
4膜活化：將PVDF膜置于甲醇活化1min，用純水洗膜2次后再用TBST洗滌3次；
5封閉：將膜條置于5%牛奶或2% BSA中，室溫混搖2h；
6一抗孵育：將待檢抗體用3%牛奶或2% BSA稀釋到合適濃度（參照抗體說(shuō)明書(shū)，根據(jù)客戶預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，稀釋度上下浮動(dòng)一個(gè)數(shù)量級(jí)都為正常），將膜放入對(duì)應(yīng)的已稀釋待檢樣品中，置4℃混搖孵育隔夜；
7洗滌：取出膜放在TBST中洗滌3×5min；
8二抗孵育：將膜取出放入稀釋好的HRP標(biāo)記的二抗（參照二抗說(shuō)明書(shū)進(jìn)行稀釋）中，室溫混搖2h；
9洗滌：取出膜放在TBST中洗滌3×5min；
10ECL顯色：將膜取出放入混勻的ECL顯色液中，孵育3min，將膜取出貼在有熒光角標(biāo)的膠片上，迅速用保鮮膜包好；
11曝光：把底片放在暗盒中，根據(jù)熒光強(qiáng)度分別對(duì)X光膠片作不同時(shí)間段的曝光，曝光結(jié)束后，將底片取出，1min顯影，30s清洗，1min定影，30s清洗，晾干；
12結(jié)果分析：用掃描儀將曝光后的X光膠片掃描，做后續(xù)結(jié)果
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