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★CQ★上海蒂科生物專注生物科研試劑：胎牛血清FBS（HAKATA、HyClone、SERANA、NTC、Corning、BOVOGEN、PAA、SIGMA等），無外泌體血清(SBI)，ELISA試劑盒（HAKATA自主品牌、進口），2萬多株細胞（含400多種類通過STR鑒定），培養(yǎng)基（干粉、液體），雙抗，胰酶，sigma試劑等。本公司優(yōu)質(zhì)供應(yīng)原裝正品胎牛血清，*的服務(wù)、真誠的態(tài)度、堅持以質(zhì)取勝，做您的實驗專家。

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★CQ★現(xiàn)象描述:

我昨天早上傳的代，晚上看還是好好的，培養(yǎng)基顏色正常，今天早上9點鐘左右，培養(yǎng)基就變渾濁了，顯微鏡下觀察細胞好多都已經(jīng)漂起來了，明顯是污染了，但我的培養(yǎng)液里明明加了雙抗了啊？

這個問題等同于，

明明有免疫系統(tǒng)的我們

為什么還是感冒了呢

★CQ★解答一

>> 加雙抗只是有一定的預(yù)防作用，但不能避免污染

現(xiàn)在很多細菌對雙抗都有耐藥性，所以加了也不一定就能殺死；雙抗的保存方式的問題，青霉素在37℃下很快就會分解掉；污染的細菌是不是在抗菌譜中；如果是真菌的話雙抗就沒有什么卵用的；

★CQ★解答二

>> 養(yǎng)細胞要從源頭做起，杜絕各種污染

剛買來的或借來的細胞株，一般都會在培養(yǎng)基中添加抗生素，待通過污染測試后，大量培養(yǎng)時則不要加抗生素；

還有就是無血清培養(yǎng)時建議zuihao不加雙抗，因為沒有血清的保護，細胞此時是比較脆弱的，很容易受到雙抗的毒副作用影響。

加雙抗并不是*除菌的方法。要防止污染除了使用雙抗，還要注意污染源大多來自換液和消化時的操作不正規(guī)，如果你在處理細胞得操作過程不規(guī)范，即便加入雙抗也很難避免污染。就像抵抗力再強的漢紙，如果任由自己在寒風中、雨雪天氣里任性，像一顆海草隨風飄搖的話，終有崩潰的一天。所以保證細胞處理過程或培養(yǎng)基配制過程中的無菌操作才是關(guān)鍵。

★CQ★解答三

>> 不是所有的細胞污染都用相同的解決辦法

很多實驗室在遇到細胞污染，準確的說是懷疑細胞受到污染（原因不明導(dǎo)致的細胞狀態(tài)不好）時，都會選擇一種處理方式——扔掉！害怕他會傳染到其他的細胞，但是往往你們?nèi)拥舻氖?ldquo;受害者”，而沒找到“真兇”。

并不是所有的細胞污染都能用扔掉解決，也并不是所有的細胞污染都可以用同一種試劑解決。

辨別細胞狀態(tài)，找到根源，“對癥下藥”才是關(guān)鍵。

（1）細菌污染 

狀態(tài)：細菌在普通倒置顯微鏡下為黑色細沙狀，根據(jù)感染細菌的不同，可有不同的外形，培養(yǎng)液一般會渾濁變黃，對細胞生長影響明顯。 

解決方法： 

1.仔細檢查一下器皿的滅菌情況，是否在高壓滅菌時放氣時間和壓力足夠！尤其是和儲存培養(yǎng)液接觸的移液管等物品，連續(xù)兩次污染的話有可能造成儲存液污染，一定要檢查培養(yǎng)液是否存在渾濁現(xiàn)象！ 

2.可在培養(yǎng)液或血清中加支原體預(yù)防劑，以及的細菌清除劑。 

（2）霉菌及真菌污染 

狀態(tài)：肉眼觀察培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基顏色基本無變化，不渾濁，但是培養(yǎng)基中由絮狀漂浮物，顯微鏡下觀察，若感染真菌可看到分叉細絲狀的結(jié)構(gòu)（不同種類結(jié)構(gòu)不同），若感染霉菌，顯微鏡下可看到片狀的結(jié)構(gòu)，不透明，真菌及霉菌對影響細胞的生長影響不大。 

解決方法： 

1.保證細胞房的干凈整潔，干燥的環(huán)境(潮濕的環(huán)境利于霉菌及真菌的生長)。 

2.控制外來人員進出實驗室。 

3.對實驗室及培養(yǎng)箱進行*消毒，推薦使用專門針對細胞培養(yǎng)環(huán)境的抑菌劑。 

4.若細胞非常珍貴，且不易獲得，可以對污染的細胞采取如下操作。 

懸浮細胞：收集細胞并離心，用PBS漂洗，重復(fù)此操作數(shù)次。貼壁細胞：用PBS輕輕沖洗細胞，重復(fù)此操作數(shù)次。加入殺滅真菌

（3）支原體感染 

狀態(tài)：顯微鏡下很難捕捉，培養(yǎng)液一般不會渾濁，國內(nèi)血清很多沒做支原體陰性檢測，而支原體是牛血清中zui常見的微生物之一。而且它不能用過濾的辦法除去。支原體感染細胞以后，細胞病變不很明顯，只是生長緩慢，直至慢慢凋亡。 

解決方法： 

>>預(yù)防：實驗室新購買的血清及培養(yǎng)基需檢測是否含有支原體，引進的新品種細胞需做支原體檢測，向培養(yǎng)基中添加支原體預(yù)防劑。 

>>補救：將支原體去除劑與*培養(yǎng)液按1:800～1000比例稀釋，加入細胞正常培養(yǎng)；并根據(jù)細胞污染的嚴重程度，處理3～6次即可*清除細胞支原體污染問題。 

（4）黑膠蟲污染 

狀態(tài)：可以穿透濾膜，也可以通過空氣傳播，低倍下為黑色點狀，高倍鏡下可看見黑色的小蟲游來游去，培養(yǎng)液不渾濁，一般不會太影響，細胞還可以用。常常可在同一批號的血清養(yǎng)的細胞中發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。

解決方法：

加入黑膠蟲去除劑，改變培養(yǎng)基的品牌。血清凍融采取逐級凍融等方法。

（5）桿菌污染

狀態(tài)：類芽孢桿菌（Paenibacillus Ash,Priest&Collin,1994）呈桿狀，革蘭氏染色陽性、陰性或可變，以周生鞭毛運動。當細胞出現(xiàn)類芽孢桿菌污染，會在顯微鏡下看到一些桿狀游動的小蟲子.

解決方法：

a. 發(fā)現(xiàn)細胞有桿菌污染，棄掉培養(yǎng)基，用PBS清洗3遍；

b. 然后按1:2000 比例加入類芽孢桿菌去除劑，即：邊加邊搖勻；

c. 每天處理一次，類芽孢桿菌去除劑連續(xù)處理3-4天，即可*清除桿菌污染。

除以上污染源外，配液消毒問題、操作問題也是污染原因之一。關(guān)于培養(yǎng)基的無菌狀況，取培養(yǎng)基至培養(yǎng)瓶中（不加細胞），37℃試培養(yǎng)一段時間后觀察，如果沒有細菌生長就是操作及細胞培養(yǎng)箱環(huán)境的問題。

★CQ★細胞培養(yǎng)，尤其是細胞系的培養(yǎng)，就細胞消化而言，多做、善于總結(jié)，就可以把細胞養(yǎng)的越來越好。

★CQ★絕大部分細胞消化只要用胰酶潤洗一遍即可：

吸去胰酶后，殘留的那些無法計算體積的附著在細胞表面的微量胰酶在37度一般不到2min足夠消化細胞（絕大部分1min不到）。對于這些細胞原則上不要用胰酶孵育細胞，連續(xù)這樣傳代，對細胞傷害很大。簡單的程序是PBS潤洗吸去，胰酶潤洗吸去，然后37度消化。

★CQ★什么算是消化好了呢？

不需要把細胞全部消化成間隔分布很離散的單個圓形才算消化好了，一般你肉眼觀察貼壁細胞層，只要能移動了，多半呈沙壯移動，其實已經(jīng)可以了。

一般能移動了，說明細胞與培養(yǎng)基質(zhì)材料的附著已經(jīng)消失了，細胞之間的附著也已經(jīng)消失了，細胞已經(jīng)獨立分布了（雖然沒有呈現(xiàn)很廣的離散分布）。這個時候應(yīng)該停止消化，不要等到看到鏡下所有細胞都分離得非常好，間隙很大，才停止。

細胞就是*成單個細胞懸液，之后在貼壁的過程中仍然會聚集，這個是貼壁培養(yǎng)的細胞，尤其是腫瘤細胞的一個特性，你可以嘗試，準備100%的單個細胞懸液，貼壁后觀察細胞，仍然是幾個幾個細胞聚集在一起。

一些懸浮培養(yǎng)細胞也是如此，容易聚集，不要過幾個小時就拿出來吹打成單細胞懸液。細胞只要能從基質(zhì)上脫離下來，即使是成片的（比如Calu-3細胞），吹打不超過20次（一般10次即可），成小規(guī)模聚集（10個細胞左右）是正常的，不要再去延長消化時間，等待單細胞懸液出現(xiàn)。

★CQ★比較難消化的細胞：

潤洗方法5min還不能消化，以結(jié)腸癌細胞為例，比如HCT15、LS411和KM12細胞，胰酶消化，一般10 cm 培養(yǎng)皿，一次zui多加入300ul-500ul就足夠了。即使這樣難消化的細胞，一般不超過5min，即可見細胞成片移動，就應(yīng)該停止消化。一些正常細胞也會有難消化的時候，比如tsDC細胞，用胰酶孵育，3min左右即可看到成片沙狀移動。

★CQ★常規(guī)的細胞實驗，受消化影響不是很大：

如果不用胰酶去孵育而使用潤洗的方法消化的話（難消化細胞例外）。但少數(shù)實驗，比如病毒包裝，對細胞代數(shù)，對細胞狀態(tài)要求*。這個時候，胰酶消化，就是潤洗，都會對細胞包裝病毒的能力有影響，傳代次數(shù)一多，細胞包裝能力就會逐漸下降。這個時候都不用胰酶消化，用一些鹽溶液（不是EDTA液）即可。這些鹽溶液通過影響細胞外基質(zhì)相關(guān)酶的活性，來使得細胞脫離基質(zhì)附著表面，但不切割任何蛋白。

★CQ★EDTA的作用：

許多人不用胰酶，只用EDTA，或者用胰酶/EDTA聯(lián)合作用。這里要明白，胰酶切割細胞外基質(zhì)的一些負責粘連和附著的蛋白，而EDTA通過螯合Ca離子，作用于整聯(lián)蛋白的活性，所以EDTA的作用更加溫和。有的人在胰酶里添加一些EDTA，或者對付特別難消化的細胞，添加多一些EDTA，就是這個道理。一般不要試圖延長消化時間（如果10min還消化不*的話），而應(yīng)該想其它辦法。

★CQ★PBS洗滌：

消化之前用PBS洗滌，是常見的操作，因為血清中含有抑制胰酶的蛋白。對于一些難消化細胞，可以配制不含Ca，Mg離子的PBS，因為這些離子也會抑制胰酶的活性。但對于絕大部分細胞用胰酶或者EDTA溶液潤洗即可消化，不需要配制不含Ca，Mg離子的溶液。

每段時間定期對細胞房、培養(yǎng)箱&水盤、水浴鍋、廢液桶等容易染菌的個角落細菌、真菌等微生物的清除，每次操作完都整理好細胞房，帶好手套、口罩、鞋套，防止人為因素污染。一旦發(fā)現(xiàn)污染，及時處理。

★CQ★細胞培養(yǎng)，尤其是細胞系的培養(yǎng)，就細胞消化而言，多做、善于總結(jié)，就可以把細胞養(yǎng)的越來越好。

★CQ★絕大部分細胞消化只要用胰酶潤洗一遍即可：

吸去胰酶后，殘留的那些無法計算體積的附著在細胞表面的微量胰酶在37度一般不到2min足夠消化細胞（絕大部分1min不到）。對于這些細胞原則上不要用胰酶孵育細胞，連續(xù)這樣傳代，對細胞傷害很大。簡單的程序是PBS潤洗吸去，胰酶潤洗吸去，然后37度消化。

★CQ★什么算是消化好了呢？

不需要把細胞全部消化成間隔分布很離散的單個圓形才算消化好了，一般你肉眼觀察貼壁細胞層，只要能移動了，多半呈沙壯移動，其實已經(jīng)可以了。

一般能移動了，說明細胞與培養(yǎng)基質(zhì)材料的附著已經(jīng)消失了，細胞之間的附著也已經(jīng)消失了，細胞已經(jīng)獨立分布了（雖然沒有呈現(xiàn)很廣的離散分布）。這個時候應(yīng)該停止消化，不要等到看到鏡下所有細胞都分離得非常好，間隙很大，才停止。

細胞就是*成單個細胞懸液，之后在貼壁的過程中仍然會聚集，這個是貼壁培養(yǎng)的細胞，尤其是腫瘤細胞的一個特性，你可以嘗試，準備100%的單個細胞懸液，貼壁后觀察細胞，仍然是幾個幾個細胞聚集在一起。

一些懸浮培養(yǎng)細胞也是如此，容易聚集，不要過幾個小時就拿出來吹打成單細胞懸液。細胞只要能從基質(zhì)上脫離下來，即使是成片的（比如Calu-3細胞），吹打不超過20次（一般10次即可），成小規(guī)模聚集（10個細胞左右）是正常的，不要再去延長消化時間，等待單細胞懸液出現(xiàn)。

★CQ★比較難消化的細胞：

潤洗方法5min還不能消化，以結(jié)腸癌細胞為例，比如HCT15、LS411和KM12細胞，胰酶消化，一般10 cm 培養(yǎng)皿，一次zui多加入300ul-500ul就足夠了。即使這樣難消化的細胞，一般不超過5min，即可見細胞成片移動，就應(yīng)該停止消化。一些正常細胞也會有難消化的時候，比如tsDC細胞，用胰酶孵育，3min左右即可看到成片沙狀移動。

★CQ★常規(guī)的細胞實驗，受消化影響不是很大：

如果不用胰酶去孵育而使用潤洗的方法消化的話（難消化細胞例外）。但少數(shù)實驗，比如病毒包裝，對細胞代數(shù)，對細胞狀態(tài)要求*。這個時候，胰酶消化，就是潤洗，都會對細胞包裝病毒的能力有影響，傳代次數(shù)一多，細胞包裝能力就會逐漸下降。這個時候都不用胰酶消化，用一些鹽溶液（不是EDTA液）即可。這些鹽溶液通過影響細胞外基質(zhì)相關(guān)酶的活性，來使得細胞脫離基質(zhì)附著表面，但不切割任何蛋白。

★CQ★EDTA的作用：

許多人不用胰酶，只用EDTA，或者用胰酶/EDTA聯(lián)合作用。這里要明白，胰酶切割細胞外基質(zhì)的一些負責粘連和附著的蛋白，而EDTA通過螯合Ca離子，作用于整聯(lián)蛋白的活性，所以EDTA的作用更加溫和。有的人在胰酶里添加一些EDTA，或者對付特別難消化的細胞，添加多一些EDTA，就是這個道理。一般不要試圖延長消化時間（如果10min還消化不*的話），而應(yīng)該想其它辦法。

★CQ★PBS洗滌：

消化之前用PBS洗滌，是常見的操作，因為血清中含有抑制胰酶的蛋白。對于一些難消化細胞，可以配制不含Ca，Mg離子的PBS，因為這些離子也會抑制胰酶的活性。但對于絕大部分細胞用胰酶或者EDTA溶液潤洗即可消化，不需要配制不含Ca，Mg離子的溶液。

每段時間定期對細胞房、培養(yǎng)箱&水盤、水浴鍋、廢液桶等容易染菌的個角落細菌、真菌等微生物的清除，每次操作完都整理好細胞房，帶好手套、口罩、鞋套，防止人為因素污染。一旦發(fā)現(xiàn)污染，及時處理。

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>> 加雙抗只是有一定的預(yù)防作用，但不能避免污染

現(xiàn)在很多細菌對雙抗都有耐藥性，所以加了也不一定就能殺死；雙抗的保存方式的問題，青霉素在37℃下很快就會分解掉；污染的細菌是不是在抗菌譜中；如果是真菌的話雙抗就沒有什么卵用的；

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還有就是無血清培養(yǎng)時建議zuihao不加雙抗，因為沒有血清的保護，細胞此時是比較脆弱的，很容易受到雙抗的毒副作用影響。

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★CQ★解答三

>> 不是所有的細胞污染都用相同的解決辦法

很多實驗室在遇到細胞污染，準確的說是懷疑細胞受到污染（原因不明導(dǎo)致的細胞狀態(tài)不好）時，都會選擇一種處理方式——扔掉！害怕他會傳染到其他的細胞，但是往往你們?nèi)拥舻氖?ldquo;受害者”，而沒找到“真兇”。

并不是所有的細胞污染都能用扔掉解決，也并不是所有的細胞污染都可以用同一種試劑解決。

辨別細胞狀態(tài)，找到根源，“對癥下藥”才是關(guān)鍵。

（1）細菌污染 

狀態(tài)：細菌在普通倒置顯微鏡下為黑色細沙狀，根據(jù)感染細菌的不同，可有不同的外形，培養(yǎng)液一般會渾濁變黃，對細胞生長影響明顯。 

解決方法： 

1.仔細檢查一下器皿的滅菌情況，是否在高壓滅菌時放氣時間和壓力足夠！尤其是和儲存培養(yǎng)液接觸的移液管等物品，連續(xù)兩次污染的話有可能造成儲存液污染，一定要檢查培養(yǎng)液是否存在渾濁現(xiàn)象！ 

2.可在培養(yǎng)液或血清中加支原體預(yù)防劑，以及的細菌清除劑。 

（2）霉菌及真菌污染 

狀態(tài)：肉眼觀察培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基顏色基本無變化，不渾濁，但是培養(yǎng)基中由絮狀漂浮物，顯微鏡下觀察，若感染真菌可看到分叉細絲狀的結(jié)構(gòu)（不同種類結(jié)構(gòu)不同），若感染霉菌，顯微鏡下可看到片狀的結(jié)構(gòu)，不透明，真菌及霉菌對影響細胞的生長影響不大。 

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2.控制外來人員進出實驗室。 

3.對實驗室及培養(yǎng)箱進行*消毒，推薦使用專門針對細胞培養(yǎng)環(huán)境的抑菌劑。 

4.若細胞非常珍貴，且不易獲得，可以對污染的細胞采取如下操作。 

懸浮細胞：收集細胞并離心，用PBS漂洗，重復(fù)此操作數(shù)次。貼壁細胞：用PBS輕輕沖洗細胞，重復(fù)此操作數(shù)次。加入殺滅真菌

（3）支原體感染 

狀態(tài)：顯微鏡下很難捕捉，培養(yǎng)液一般不會渾濁，國內(nèi)血清很多沒做支原體陰性檢測，而支原體是牛血清中zui常見的微生物之一。而且它不能用過濾的辦法除去。支原體感染細胞以后，細胞病變不很明顯，只是生長緩慢，直至慢慢凋亡。 

解決方法： 

>>預(yù)防：實驗室新購買的血清及培養(yǎng)基需檢測是否含有支原體，引進的新品種細胞需做支原體檢測，向培養(yǎng)基中添加支原體預(yù)防劑。 

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（4）黑膠蟲污染 

狀態(tài)：可以穿透濾膜，也可以通過空氣傳播，低倍下為黑色點狀，高倍鏡下可看見黑色的小蟲游來游去，培養(yǎng)液不渾濁，一般不會太影響，細胞還可以用。常常可在同一批號的血清養(yǎng)的細胞中發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。

解決方法：

加入黑膠蟲去除劑，改變培養(yǎng)基的品牌。血清凍融采取逐級凍融等方法。

（5）桿菌污染

狀態(tài)：類芽孢桿菌（Paenibacillus Ash,Priest&Collin,1994）呈桿狀，革蘭氏染色陽性、陰性或可變，以周生鞭毛運動。當細胞出現(xiàn)類芽孢桿菌污染，會在顯微鏡下看到一些桿狀游動的小蟲子.

解決方法：

a. 發(fā)現(xiàn)細胞有桿菌污染，棄掉培養(yǎng)基，用PBS清洗3遍；

b. 然后按1:2000 比例加入類芽孢桿菌去除劑，即：邊加邊搖勻；

c. 每天處理一次，類芽孢桿菌去除劑連續(xù)處理3-4天，即可*清除桿菌污染。

除以上污染源外，配液消毒問題、操作問題也是污染原因之一。關(guān)于培養(yǎng)基的無菌狀況，取培養(yǎng)基至培養(yǎng)瓶中（不加細胞），37℃試培養(yǎng)一段時間后觀察，如果沒有細菌生長就是操作及細胞培養(yǎng)箱環(huán)境的問題。 

★CQ★TIPs：細胞操作及細胞培養(yǎng)箱環(huán)境問題如何解決？ 

1、提高細胞操作技巧，禁止交叉使用槍頭，在酒精燈火焰5公分距離內(nèi)操作。 

2、定期對細胞培養(yǎng)箱消毒，培養(yǎng)箱水盤中的水也要定期更換，并使用無菌水。 

3、進入細胞房之前及在無菌操作臺操作細胞實驗之前需使用紫外燈照射30min。定期使用細胞房除菌劑對細胞房空間進行處理。

4、每次開培養(yǎng)箱之前需用酒精消毒雙手。 

5、用培養(yǎng)箱除菌劑和水盤抑菌劑定期對培養(yǎng)箱進行消毒。 

6、配制的培養(yǎng)基需驗證無菌后方可進行細胞培養(yǎng)。